{"id":333,"date":"2014-08-15T21:52:54","date_gmt":"2014-08-15T19:52:54","guid":{"rendered":"http:\/\/www.dubochet.ch\/jacques\/?p=333"},"modified":"2015-01-24T14:56:21","modified_gmt":"2015-01-24T13:56:21","slug":"cryo-microscopie-electronique-2014","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.dubochet.ch\/jacques\/?p=333","title":{"rendered":"Cryo-microscopie \u00e9lectronique 2014."},"content":{"rendered":"

Il y a 33 ans, dans mon labo au EMBL, Alasdair McDowall montrait que l\u2019eau pouvait \u00eatre vitrifi\u00e9e, c\u2019est \u00e0 dire immobilis\u00e9e par le froid sans en changer la structure\u00a0 (1). Pour la microscopie \u00e9lectronique, cette d\u00e9couverte ouvrait, en principe, la possibilit\u00e9 d\u2019observer la mati\u00e8re vivante dans son milieu aqueux alors que, jusque-l\u00e0, tous les sp\u00e9cimens \u00e9taient obligatoirement d\u00e9shydrat\u00e9s, ce qui est fort f\u00e2cheux puisque l\u2019eau est de loin le composant le plus abondant de la mati\u00e8re vivante.\u00a0 Deux ans plus tard, le r\u00eave \u00e9tait r\u00e9alis\u00e9 pour les suspensions, c\u2019est-\u00e0-dire pour toutes les particules biologiques flottant en solution liquide, gr\u00e2ce \u00e0 la m\u00e9thode de vitrification en couche mince que quelques trucs \u00e9tonnants de Marc Adrien avaient rendue possible(2). Aujourd\u2019hui, ce sont plus de 1000 scientifiques qui en ont fait leur outil de travail. En m\u00eame temps, nous mettions en chantier l\u2019improbable projet CEMOVIS (le nom n\u2019est venu que plus tard) destin\u00e9 \u00e0 \u00e9tendre le potentiel de la vitrification\u00a0 \u00e0 des objets massifs tels que les tissus ou des organismes complexes. H\u00e9las, aujourd\u2019hui, les cemovistes se comptent encore sur les doigts (mains et pieds).<\/p>\n

J\u2019\u00e9tais r\u00e9cemment \u00e0 Barcelone, pour la Gordon Research Conference 3d-EM qui r\u00e9unit toutes les ann\u00e9es la cr\u00e8me des sp\u00e9cialistes de la cryo-microscopie \u00e9lectronique (cryo-me). On savait qu\u2019il se passait des choses remarquables, mais, synth\u00e8se faite, une impression unanime ressort de cette conf\u00e9rence\u00a0: la cryo-me semble\u00a0en voie de produire une r\u00e9volution en biologie structurale (0). De quoi il s\u2019agit-il\u00a0?<\/p>\n

Dans ses fameuses \u00ab\u00a0Lectures on Physics\u00a0\u00bb Feynman propose que si une seule phrase devait \u00eatre transmise aux g\u00e9n\u00e9rations futures, il choisirait\u00a0: \u00ab\u00a0le monde est fait d\u2019atomes\u00bb. En effet, la structure atomique est la voie royale pour comprendre comment fonctionne le monde \u2013 ou une de ses parties. Par exemple, en biologie, c\u2019est en r\u00e9solvant la structure atomique de l\u2019ADN que Watson et Crick ont imm\u00e9diatement pu comprendre le fondement de la r\u00e9plication des organismes vivants. Le d\u00e9part \u00e9tait fracassant, la suite fut plus laborieuse (la vie est tr\u00e8s compliqu\u00e9e). Le fait est que la connaissance de la structure atomique est n\u00e9cessaire pour comprendre le fondement de n\u2019importe quel processus biologique.<\/p>\n

Par exemple, l\u2019aquaporine est une prot\u00e9ine que Christine aime bien parce qu\u2019elle est vant\u00e9e dans une cr\u00e8me \u00ab\u00a0jeunesse pour la peau\u00a0\u00bb. C\u2019est elle qui contr\u00f4le la quantit\u00e9 d\u2019eau dans les cellules. Il s\u2019agit d\u2019un canal si fin, qu\u2019il ne laisse passer qu\u2019une mol\u00e9cule \u00e0 la fois \u2013 mais il peut en laisser passer un milliard \u00e0 la seconde \u2013, ou qui se ferme par le\u00a0tout petit d\u00e9placement de quelques atomes du bord du canal.\u00a0 Il faut regarder de tr\u00e8s pr\u00e8s pour comprendre comment fonctionne le canal.<\/p>\n

La m\u00e9thode qui a le plus apport\u00e9 \u00e0 l\u2019\u00e9tude des structures atomiques est la diffraction de rayons X (DX) dont on a f\u00eat\u00e9 r\u00e9cemment les 100 ans d\u2019existence. Elle est devenue une v\u00e9ritable industrie, tr\u00e8s comp\u00e9titive et tr\u00e8s li\u00e9e \u00e0 l\u2019industrie des m\u00e9dicaments. La PDB (la base de donn\u00e9es des structures mol\u00e9culaires biologiques) contient pr\u00e8s de 100’000 entr\u00e9es provenant de la DX. Malheureusement, par principe, la\u00a0DX ne regarde pas vraiment les objets, mais les cristaux qu\u2019ils peuvent former. Il faut imaginer que, en regardant la forme d\u2019un cristal atomique, on puisse d\u00e9duire comment les atomes sont arrang\u00e9s. L\u2019affaire est plus complexe pour une grosse mol\u00e9cule, mais le principe est le m\u00eame. La n\u00e9cessit\u00e9 de cristallisation est une s\u00e9v\u00e8re limite. En g\u00e9n\u00e9ral, dans un cristal, une mol\u00e9cule ne \u00ab\u00a0fonctionne\u00a0\u00bb pas. Comment voir alors, par exemple, comment s\u2019ouvre et se ferme l\u2019aquaporine\u00a0?<\/p>\n

La PDB contient aussi environ 10’000 entr\u00e9es qui proviennent d\u2019une m\u00e9thode toute diff\u00e9rente, la RMN. La m\u00e9thode est difficile et pas souvent applicable.<\/p>\n

Finalement, on y trouve aussi 2000 entr\u00e9es venant de la microscopie \u00e9lectronique. C\u2019est peu et, de ces 2000, seulement quelques-unes sont \u00e0 une r\u00e9solution atomique. Il faut bien l\u2019admettre, jusqu\u2019\u00e0 pr\u00e9sent, la microscopie \u00e9lectronique n\u2019\u00e9tait que rarement une m\u00e9thode de d\u00e9termination des structures atomiques.<\/p>\n

Pourtant elle a un avantage majeur\u00a0: elle donne une vraie image.<\/p>\n

Alors, o\u00f9 est le probl\u00e8me\u00a0? En fait, il y en a trois.<\/p>\n

1) Pr\u00e9paration des sp\u00e9cimens conservant la structure exacte, dans l\u2019\u00e9tat d\u00e9sir\u00e9 (par exemple, l\u2019aquaporine dans une conformation ouverte ou ferm\u00e9e).<\/p>\n

2) D\u00e9duire la structure 3-dimensionnelle de l\u2019objet \u00e0 partir d\u2019images qui en sont des projections \u00e0 deux dimensions.<\/p>\n

3) \u00c9viter les d\u00e9g\u00e2ts que le faisceau d\u2019\u00e9lectrons fait subir au sp\u00e9cimen.<\/p>\n

Voyons plus en d\u00e9tail.<\/p>\n

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1) C\u2019est le travail des biochimistes de pr\u00e9parer l\u2019objet de recherche, une belle structure, bien pure et dans la conformation d\u00e9sir\u00e9e. Le plus souvent, il s\u2019agit d\u2019isoler un de ces superarrangements de macromol\u00e9cules formant une entit\u00e9 fonctionnelle, machine \u00e9l\u00e9mentaire de la vie. L\u2019aquaporine en est un exemple relativement simple (groupement de 4 prot\u00e9ines identiques)\u00a0; le ribosome \u2013 la machine qui synth\u00e9tise les prot\u00e9ines – est beaucoup plus complexe avec environ un demi-million d\u2019atomes pr\u00e9cis\u00e9ment group\u00e9s en une cinquantaine de prot\u00e9ines et 3 morceaux d\u2019ARN; incluons aussi tous les virus et toutes les structures cellulaires qu\u2019il est possible d\u2019isoler fonctionnellement. L\u2019un dans l\u2019autre, la galerie est presque infinie.<\/p>\n

Le biochimiste ayant bien fait son boulot, il s\u2019agit de pr\u00e9senter ce mat\u00e9riel dans le microscope \u00e9lectronique. Le probl\u00e8me \u00e9tait sans espoir tant que les sp\u00e9cimens devaient \u00eatre d\u00e9shydrat\u00e9s. Pourtant, durant les 50 premi\u00e8res ann\u00e9es de la microscopie \u00e9lectronique, la d\u00e9shydratation semblait \u00eatre dans la nature de la m\u00e9thode parce que l\u2019air n\u2019est pas transparent aux \u00e9lectrons et que, cons\u00e9quemment, la colonne d\u2019un microscope \u00e9lectronique doit donc \u00eatre sous vide. H\u00e9las, l\u2019eau s\u2019\u00e9vapore en absence d\u2019air. Tout le drame \u00e9tait l\u00e0.<\/p>\n

La cryo-microscopie a r\u00e9solu le probl\u00e8me. Selon la m\u00e9thode de Marc Adrian, une tr\u00e8s mince couche de suspension\u00a0 (1\/10 de \u00b5m) contenant les particules \u00e0 \u00e9tudier est tendue comme une membrane sur un trou (qcq. \u00b5m de diam\u00e8tre) avant d\u2019\u00eatre projet\u00e9e dans un bon cryog\u00e8ne qui la vitrifie \u00e0 -160\u00b0C en moins d\u2019un millioni\u00e8me de seconde\u00a0; c\u2019est du moins ce que l\u2019on imagine, car on n\u2019a jamais pu mesurer pr\u00e9cis\u00e9ment la vitesse de cong\u00e9lation. \u00a0 La m\u00e9thode est simple, facile et reproductible\u00a0; il suffit d\u2019exercer les petits tours de main qui font l\u2019harmonie de la manipulation. L\u2019observation se fait vers -180\u00b0C dans un cryo-microscope \u00e9lectronique\u00a0; les constructeurs ont remarquablement travaill\u00e9\u00a0et, si on\u00a0 y met le prix, leurs machines fonctionnent presque parfaitement. L\u2019essentiel est que, \u00e0 cette temp\u00e9rature, l\u2019eau vitrifi\u00e9e ne s\u2019\u00e9vapore pas et le sp\u00e9cimen se pr\u00e9sente comme s\u2019il \u00e9tait dans son \u00e9tat natif.\u00a0 En fait, il y aurait ici pas mal de subtilit\u00e9s \u00e0 mentionner, mais laissons \u00e7a aux professionnels.<\/p>\n

2) La deuxi\u00e8me difficult\u00e9 vient du fait qu\u2019une image n\u2019est pas l\u2019objet \u00e0 3 dimensions que l\u2019on souhaite repr\u00e9senter. Le probl\u00e8me est classique. Notre cerveau le r\u00e9sout magnifiquement \u00e0 partir des images que lui fournissent nos yeux. La m\u00e9thode standard consiste \u00e0 construire un mod\u00e8le \u00e0 trois dimensions \u00e0 partir de projections de l\u2019objet dans plusieurs directions. C\u2019est ainsi que fonctionne la tomographie aux rayons X\u00a0et, pour ce faire, c\u2019est\u00a0 la cam\u00e9ra qui tourne autour de l\u2019objet pour bien le voir sous toutes les coutures. La m\u00eame m\u00e9thode s\u2019applique en microscopie \u00e9lectronique, mais elle est difficile parce que l\u2019objet est tr\u00e8s petit. Il faut contr\u00f4ler les mouvements avec une pr\u00e9cision un million de fois meilleures que pour la tomographie m\u00e9dicale. C\u2019est pourtant possible et l\u2019on tire, ici encore, un grand coup de chapeau \u00e0 ceux qui d\u00e9veloppent ces instruments.<\/p>\n

Mais il y a mieux. Chaque sp\u00e9cimen \u00e0 observer au microscope \u00e9lectronique ne contient pas seulement une particule, mais il en pr\u00e9sente g\u00e9n\u00e9ralement des milliers ou des millions immobilis\u00e9s au hasard dans la mince couche de suspension vitrifi\u00e9e. Ainsi, une seule image peut contenir des centaines de particules identiques, toutes orient\u00e9es diff\u00e9remment. L\u2019information 3-d est donc l\u00e0\u00a0; il suffit de la mettre en ordre.\u00a0 La th\u00e9orie n\u2019est pas r\u00e9volutionnaire, mais sa mise en application est une tr\u00e8s grosse affaire. Il y a 50 ans qu\u2019on y travaille. Comme souvent, les gens de Cambridge ont \u00e9t\u00e9 remarquables (Klug, Crowther, Unwin, Henderson<\/span>), mais il y en a d\u2019autres, nombreux, qui participent au progr\u00e8s de ce vaste domaine au rythme battu par le d\u00e9veloppement de l\u2019informatique.<\/p>\n

3) Pour voir un objet, il faut l\u2019\u00e9clairer\u00a0; pour voir un objet tr\u00e8s petit, il faut l\u2019\u00e9clairer beaucoup\u00a0; pour voir un atome, il faut l\u2019\u00e9clairer tellement qu\u2019il est r\u00f4ti avant d\u2019\u00eatre vu. Que l\u2019\u00e9clairage soit de la lumi\u00e8re ou des \u00e9lectrons n\u2019y change rien. Parce que la chimie organique est d\u00e9licate, la r\u00e9solution atomique est fondamentalement impossible sur un objet biologique.<\/p>\n

Impossible sur un objet unique, mais possible sur un grand nombre d\u2019objets identiques. Ainsi l\u2019analyse des macromol\u00e9cules par diffraction des rayons X fait appel \u00e0 des cristaux, form\u00e9s d\u2019un tr\u00e8s grand nombre de mol\u00e9cules identiques arrang\u00e9es r\u00e9guli\u00e8rement. Ainsi, et juste pour illustrer l\u2019id\u00e9e, supposons que l\u2019atome No\u00a042 de la 850e mol\u00e9cule dans le cristal ait donn\u00e9 un signe de sa pr\u00e9sence. La cons\u00e9quence est que maintenant, il n\u2019est plus au m\u00eame endroit. Qu\u2019importe, sur celui-ci, on ne reviendra pas, le compl\u00e9ment d\u2019information pour localiser ce fameux atome 42 de la mol\u00e9cule, nous le prendrons dans une autre des mol\u00e9cules du cristal. Bref, en diluant les d\u00e9g\u00e2ts sur un tr\u00e8s grand nombre de mol\u00e9cules, chaque mol\u00e9cule reste presque intacte en moyenne. Ainsi, chacun mol\u00e9cule parle peu, mais, ensemble elles disent tout ce qu\u2019il faut pour en d\u00e9terminer la structure atomique.<\/p>\n

La solution de la microcopie \u00e9lectronique est plus int\u00e9ressante. Au lieu d\u2019exiger que les particules soient arrang\u00e9es en cristal, nous allons nous contenter d\u2019un grand nombre de particules identiques orient\u00e9es au hasard. Il suffit pour cela que le biochimiste obtienne une belle suspension homog\u00e8ne de particules, toutes dans le m\u00eame \u00e9tat. L\u2019\u00e9tape de la cristallisation n\u2019a plus lieu d\u2019\u00eatre. La plus grande limitation de la diffraction des rayons X ne nous concerne pas. Ce que nous avons \u00e0 faire \u2013 ou plut\u00f4t, ce que l\u2019ordinateur fera pour nous \u2013 consiste \u00e0 d\u00e9duire l\u2019orientation de chacune des particules par rapport \u00e0 une direction fix\u00e9e arbitrairement. Math\u00e9matiquement, il s\u2019agit d\u2019extraire de l\u2019image de chaque particule, la valeur des 3 angles d\u2019Euler, c\u2019est-\u00e0-dire trois unit\u00e9s d\u2019information dans une image qui en contient beaucoup plus puis, de sommer dans l\u2019espace 3-d l\u2019information de toutes les particules. Le calcul se fait par approximations successives sur l\u2019ensemble de toutes les donn\u00e9es\u00a0; c\u2019est un gros calcul. Les ordinateurs actuels le font diligemment.<\/p>\n

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Ainsi donc, les 3 probl\u00e8mes de base de la d\u00e9termination des structures mol\u00e9culaires par microscopie \u00e9lectronique sont en principe r\u00e9solus pour toute suspension homog\u00e8ne de particules biologiques (3). Wouah\u00a0! Et alors.<\/p>\n

En 1986 \u00a0 nous avons r\u00e9alis\u00e9 la premi\u00e8re reconstruction 3-d selon la m\u00e9thodologie d\u00e9crite ci-dessus (4). Il s\u2019agissait du SMV (virus de la for\u00eat Semliki). Notre mod\u00e8le avait une r\u00e9solution de 35\u00c5.<\/p>\n

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\"4200_SFV_cover_Nature\"<\/a><\/p>\n

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Aujourd\u2019hui, nos meilleurs coll\u00e8gues r\u00e9solvent des structures semblables \u00e0 moins de 3.5\u00c5. En absence de toute sym\u00e9trie, c\u2019est-\u00e0-dire, quand le probl\u00e8me est le plus difficile, il devient \u00ab\u00a0normal\u00a0\u00bb d\u2019atteindre 4.5\u00c5.\u00a0 C\u2019est le cas de ce mitoribosome (5) publi\u00e9 r\u00e9cemment par\u00a0un groupe de Cambridge.<\/p>\n

\"Capture<\/a><\/p>\n

Par rapport aux r\u00e9sultats d\u2019il y a 30 ans le progr\u00e8s est \u00e9tonnant. D\u2019abord il faut constater qu\u2019une am\u00e9lioration d\u2019un facteur 10 de la r\u00e9solution signifie que l\u2019\u00e9l\u00e9ment de volume est 1000 fois plus petit. Ainsi, pour des objets de m\u00eame dimension, les cartes actuelles contiennent 1000 fois plus d\u2019information que celles du d\u00e9but de la cryo-microscopie \u00e9lectronique. Il faut savoir encore qu\u2019un mod\u00e8le reconstruit \u00e0 une r\u00e9solution approchant 3\u00c5 permet de localiser chaque atome dans sa juste position. L\u2019image du mitoribosome ci-dessus ne fait pas justice \u00e0 ce qu\u2019elle repr\u00e9sente\u00a0; il y a simplement trop d\u2019information\u00a0pour la montrer; autant d\u2019atomes plac\u00e9s dans leur juste position que d\u2019habitant dans la r\u00e9gion zurichoise. Qu\u2019importe, l\u2019information est l\u00e0. Elle peut \u00eatre exploit\u00e9e.<\/p>\n

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Comment ce progr\u00e8s a-t-il \u00e9t\u00e9 rendu possible\u00a0? En fait, depuis la vitrification, il n\u2019y a pas eu de d\u00e9couverte fondamentale. La m\u00e9thode de pr\u00e9paration des suspensions en mince couche vitrifi\u00e9e que nous avons d\u00e9crite en 1986 est toujours la m\u00e9thode de base, utilis\u00e9e sans modifications notables, si ce n\u2019est que beaucoup la pratique \u00e0 l\u2019aide d\u2019une machine tr\u00e8s ch\u00e8re et tr\u00e8s automatique qui, au dire des plus exp\u00e9riment\u00e9s, n\u2019apporte pas grand-chose. Si la m\u00e9thode de pr\u00e9paration est rest\u00e9e la m\u00eame, le nombre de ceux qui la pratiquent a chang\u00e9 d\u2019ordre de grandeur. En discussion informelle \u00e0 la r\u00e9cente conf\u00e9rence de Barcelone, nous avons estim\u00e9 que, par le monde, ils doivent d\u00e9passer le millier.\u00a0 Par contre, depuis les origines de la cryo-me, le traitement des images a immens\u00e9ment \u00e9volu\u00e9 en parall\u00e8le avec l\u2019effarante augmentation de la puissance des ordinateurs et les vastes efforts en math\u00e9matique appliqu\u00e9e qui ont permis d\u2019en tirer avantage. Il semble toutefois que LE progr\u00e8s qui, ces derni\u00e8res ann\u00e9es,\u00a0 fait LA diff\u00e9rence soit d\u00fb \u00e0 une nouvelle classe de d\u00e9tecteurs d\u2019image.\u00a0 La plupart d\u2019entre nous en\u00a0 ont \u00e9t\u00e9 surpris. Pas tous, il y a longtemps que Richard Henderson insistait que l\u00e0 \u00e9tait le goulet d\u2019\u00e9tranglement. En principe, le probl\u00e8me est simple\u00a0; il y a des \u00e9lectrons qui forment une image\u00a0; il suffit d\u2019annoncer leur arriv\u00e9e, l\u2019un apr\u00e8s l\u2019autre, chacun \u00e0 sa place. Il suffit\u00a0! Mais quand il s\u2019agit d\u2019un milliard d\u2019\u00e9lectrons par seconde,\u00a0 risquant de se confondre entre eux dans un bruit de fond compliqu\u00e9, le probl\u00e8me est techniquement consid\u00e9rable. Les constructeurs nous l\u2019annon\u00e7aient r\u00e9solu depuis 20 ans, mais les utilisateurs avis\u00e9s, constataient d\u00e9\u00e7us, que ce ne f\u00fbt gu\u00e8re le cas. Apparemment la situation a chang\u00e9. Richard avait raison\u00a0; il y a des scientifiques qui sont vraiment tr\u00e8s, tr\u00e8s bons.<\/p>\n

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En atteignant\u00a0 le domaine des 3.5 \u00c5 et, cons\u00e9quemment, la r\u00e9solution atomique, la cryo-me change qualitativement\u00a0; elle passe du domaine purement structural \u00e0 celui de la chimie. De la question \u00ab\u00a0quelle est la forme\u00a0?\u00a0\u00bb, on passe \u00e0 \u00ab\u00a0comment \u00e7a marche\u00a0?\u00a0\u00bb. L\u2019information prend une valeur nouvelle et c\u2019est justement cela qui provoquait la grande agitation ressentie \u00e0 la r\u00e9cente conf\u00e9rence de Barcelone.\u00a0 Ainsi, la cryo-me va gagner en int\u00e9r\u00eat, en int\u00e9r\u00eat commercial d\u2019abord. La diffraction des rayons X conna\u00eet le probl\u00e8me depuis des d\u00e9cennies\u00a0; elle re\u00e7oit des flots d\u2019argents, mais de l\u2019argent int\u00e9ress\u00e9. La cons\u00e9quence est que, dans ce domaine, les chercheurs ne se parlent plus et ne communiquent leurs r\u00e9sultats qu\u2019apr\u00e8s en avoir assur\u00e9 l\u2019utilisation commerciale.\u00a0 Henning Stahlberg concluait la conf\u00e9rence en appelant \u00e0 d\u00e9fendre l\u2019ouverture de notre domaine. Certains pensent que la bataille est perdue d\u2019avance. Je vois que le verre n\u2019est ni vide ni plein. Certains contribueront \u00e0 le remplir, d\u2019autres \u00e0 le vider. Chaque cryo-microscopiste choisira son camp. J\u2019observerai la bataille.<\/p>\n

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Un chapitre est encore \u00e0 \u00e9crire pour compl\u00e9ter la saga de la cryo-me\u00a0: CEMOVIS. Jusqu\u2019ici nous avons vu comment pouvait \u00eatre r\u00e9solue la structure de particules que l\u2019on a pu pr\u00e9parer en grand nombre de copies identiques. En g\u00e9n\u00e9ral, ce n\u2019est pas possible\u00a0;\u00a0 deux \u00eatres vivants ne sont jamais identiques et deux morceaux de mati\u00e8re vivante sont toujours diff\u00e9rents. Il n\u2019est pas possible de superposer les fragments d\u2019informations lacunaires provenant de particules\u00a0 diff\u00e9rentes pour en faire un tout complet. Il faut se contenter de ce qui peut offrir l\u2019objet unique. Puisqu\u2019une image ne suffit pas \u00e0\u00a0 reconstruire l\u2019objet 3-d il faut l\u2019observer sous toutes ses coutures. Faute de pouvoir tourner autour, c\u2019est l\u2019objet qu\u2019il faut le faire tourner.\u00a0 Pratiquement il s\u2019agit de photographier le sp\u00e9cimen en changeant son orientation de degr\u00e9 en degr\u00e9 puis d\u2019en faire un mod\u00e8le 3-d sur la base des quelque 100 images que l\u2019on peut enregistrer en un seul tomogramme. On l\u2019a compris, le sp\u00e9cimen trop fragile pour donner une image en haute r\u00e9solution ne r\u00e9sistera pas mieux \u00e0 100 images. Cette limite incontournable se paie en perte de r\u00e9solution. Encore en perte de r\u00e9solution se paie la complexit\u00e9 due \u00e0 la masse d\u2019information qui se superpose dans l\u2019\u00e9paisseur du sp\u00e9cimen.<\/p>\n

Le projet de cryo-me que nous avions lanc\u00e9 au d\u00e9but des ann\u00e9es 80 comprenait aussi un volet visant \u00e0 observer les structures complexes de la cellule. Il s\u2019agissait donc de vitrifier un volume substantiel de mati\u00e8re biologique, de le couper en section ultramince que l\u2019on observe directement en cryo-me. Pour la suite nous esp\u00e9rions que les techniques de tomographie pourraient conduire \u00e0 la mod\u00e9lisation 3-d. Le programme \u00e9tait plus qu\u2019ambitieux\u00a0; il semblait utopique\u00a0; bien plus tard nous avons donn\u00e9 \u00e0 la technique le nom de CEMOVIS\u00a0: cryo-electron-nanoscopy of vitreous sections. <\/span>L\u2019EMBL offrait un des rares lieux o\u00f9 un tel programme pouvait \u00eatre poursuivi. Une position de professeur dans une universit\u00e9 suisse peut aussi offrir quelquefois une pareille possibilit\u00e9, s\u2019il reste en parall\u00e8le avec un programme plus standard et plus rapidement\u00a0 productif \u2013 ma foi, il faut bien vivre. Moi, je n\u2019ai jamais r\u00e9ussi \u00e0 pratiquer CEMOVIS \u2013 trop diversement occup\u00e9 et de mains insuffisamment sures \u2013, mais, depuis 1982 jusqu\u2019\u00e0 ma retraite en 2007 il y a toujours eu, dans mon laboratoire, au moins un doctorant ou un post-doc qui se consacrait au d\u00e9veloppement de CEMOVIS. La communaut\u00e9 de la cryo-me a toujours reconnu unanimement la beaut\u00e9 de l\u2019id\u00e9e CEMOVIS, un bon nombre de scientifiques\u00a0 s\u2019y sont essay\u00e9s, mais aujourd\u2019hui les CEMOVIStes exp\u00e9riment\u00e9s se comptent encore sur les doigts (mains et pieds). C\u2019est peu par rapport aux plus de milles qui pratiquent la cryo-me des suspensions en couche mince.<\/p>\n

Il y a plus de 10 ans que de belles reconstructions tomographiques de cellules aplaties, vitrifi\u00e9es en couche mince sont r\u00e9guli\u00e8rement pr\u00e9sent\u00e9es. Les quelques reconstructions semblables\u00a0 obtenues par CEMOVIS atteignent une meilleure r\u00e9solution parce que les sections sont plus fines. Les\u00a0 progr\u00e8s qui marquent la cryo-me des couches minces se r\u00e9percutent aussi dans la reconstruction tomographique\u00a0 et certaines reconstructions du contenu cellulaire qui ont \u00e9t\u00e9 pr\u00e9sent\u00e9es \u00e0 la conf\u00e9rence de Barcelone ont laiss\u00e9\u00a0 l\u2019assistance effar\u00e9e. On est loin de la r\u00e9solution atomique, mais en appliquant les m\u00eames moyens aux sp\u00e9cimens beaucoup plus minces\u00a0 que peut produire CEMOVIS, on peut r\u00eaver d\u2019atteindre les 10\u00c5 \u2013 pas dans un avenir ind\u00e9fini, mais d\u00e8s maintenant. Il sera possible de reconnaitre des prot\u00e9ines sp\u00e9cifiques ou autres structures caract\u00e9ristiques \u00e0 leur forme et peut-\u00eatre \u00e0 l\u2019orientation de leur arrangement atomiques les plus marquantes. Il serait alors possible de suivre, par exemple le trac\u00e9 de l\u2019ADN \u00e0 l\u2019int\u00e9rieur du noyau cellulaire (c\u2019est mon r\u00eave depuis 25 ans) et de mettre en position les \u00e9l\u00e9ments dont on conna\u00eet par ailleurs la structure atomique\u00a0 (par diffraction X ou cryo-me de particules isol\u00e9es) pour \u00e9tablir ainsi un mod\u00e8le atomique r\u00e9aliste objet biologique complexe. La composition imaginative du bouton synaptique que proposait r\u00e9cemment la couverture de Science pourrait devenir de la vraie r\u00e9alit\u00e9 (5).<\/p>\n

\"Synapse\"<\/a><\/p>\n

Et ainsi, o\u00f9 vais-je me retrouver dans quelques ann\u00e9es? Je n\u2019ai pas d\u00e9couvert ou invent\u00e9 la cryo-me, mais on m\u2019en reconna\u00eet la paternit\u00e9 (6). Vieux gourou, je le suis et vais le rester. J\u2019en suis bien aise sans que ceci n\u2019influence gu\u00e8re mon quotidien. Se peut-il que l\u2019agitation actuelle vienne me chercher\u00a0? La probabilit\u00e9 n\u2019est pas consid\u00e9rable, 20% peut-\u00eatre. Si c\u2019est le cas, il faudra la prendre avec d\u00e9licatesse.<\/p>\n

 <\/p>\n

Notes\u00a0:<\/p>\n

0)\u00a0Smith, M. T. J. and J. L. Rubinstein (2014). \u00ab\u00a0Beyond blob-ology.\u00a0\u00bb Science 345<\/b>(6197): 617 – 619.<\/p>\n

1) En fait, nous n\u2019\u00e9tions pas les premiers \u00e0 faire cette d\u00e9couverte inattendue\u00a0; l\u2019article d\u2019un groupe autrichien (a) \u00e9tait sous presse dans Nature quand nous avons soumis le n\u00f4tre \u00e0 la m\u00eame revue. L\u2019histoire de l\u2019\u00e9v\u00e8nement est retrac\u00e9e dans (b).<\/p>\n

a) Mayer, E. and P. Br\u00fcggeller (1980). \u00ab\u00a0Complete vitrification in pure liquid water and dilute aqueous solutions.\u00a0\u00bb Nature 288: 569-571.<\/span><\/p>\n

b) Dubochet, J. (2011). \u00ab\u00a0Cryo-EM – The first thirty years.<\/span>\u00a0\u00bb J. Microscopy 245(3): 221 – 224.<\/p>\n

2) Adrian, M., et al. (1984). \u00ab\u00a0Cryo-electron microscopy of viruses.<\/span>\u00a0\u00bb Nature 308: 32-36.<\/p>\n

3) Pas tout \u00e0 fait. Si la particule est trop petite, chaque image pourrait ne pas contenir assez d\u2019information pour d\u00e9terminer les 3 angles d\u2019Euler. L\u2019addition des informations entre les images des diff\u00e9rentes particules n\u2019est pas possible. Nous sommes ainsi dans la situation paradoxale que ce sont les particules les plus simples qui \u00e9chappent \u00e0 la microscopie \u00e9lectronique. Tant pis, ce sont les structures pour lesquelles la diffraction X et la RMN\u00a0 sont particuli\u00e8rement bien adapt\u00e9es.<\/p>\n

4) Vogel, R. H., et al. (1986). \u00ab\u00a0<\/span>Envelope structure of semliki forest virus reconstructed from cryo-electron micrographs.\u00a0\u00bb Nature 320: 533-535.<\/span><\/p>\n

5)\u00a0<\/span>Amunts, A., et al. (2014). \u00ab\u00a0Structure of the Yeast Mitochondrial Large Ribosomal Subunit.\u00a0\u00bb Science 343<\/b>: 1485-1489.<\/p>\n

6) Henderson, R. (2004). \u00ab\u00a0<\/span>Realizing the potential of electron cryo-microscopy.\u00a0\u00bb Q Rev Biophys. 37: 3-13.<\/span><\/p>\n

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Il y a 33 ans, dans mon labo au EMBL, Alasdair McDowall montrait que l\u2019eau pouvait \u00eatre vitrifi\u00e9e, c\u2019est \u00e0 dire immobilis\u00e9e par le froid sans en changer la structure\u00a0 (1). Pour la microscopie \u00e9lectronique, cette d\u00e9couverte ouvrait, en principe, la possibilit\u00e9 d\u2019observer la mati\u00e8re vivante dans son milieu aqueux alors que, jusque-l\u00e0, tous les […]<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"jetpack_post_was_ever_published":false,"footnotes":"","jetpack_publicize_message":"","jetpack_publicize_feature_enabled":true,"jetpack_social_post_already_shared":false,"jetpack_social_options":{"image_generator_settings":{"template":"highway","default_image_id":0,"font":"","enabled":false},"version":2}},"categories":[1],"tags":[104,101,167,97,98,67,99,61,77,102,4,103],"class_list":["post-333","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-article","tag-atome","tag-cemovis","tag-cryome","tag-eau","tag-electron","tag-image","tag-microscopie-electronique","tag-modele","tag-structure","tag-tomographie","tag-virus","tag-vitrification"],"jetpack_publicize_connections":[],"jetpack_featured_media_url":"","jetpack-related-posts":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.dubochet.ch\/jacques\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts\/333","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.dubochet.ch\/jacques\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.dubochet.ch\/jacques\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dubochet.ch\/jacques\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dubochet.ch\/jacques\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fcomments&post=333"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.dubochet.ch\/jacques\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts\/333\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.dubochet.ch\/jacques\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fmedia&parent=333"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dubochet.ch\/jacques\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fcategories&post=333"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dubochet.ch\/jacques\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Ftags&post=333"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}