Cryo-microscopie électronique 2014.

Il y a 33 ans, dans mon labo au EMBL, Alasdair McDowall montrait que l’eau pouvait être vitrifiée, c’est à dire immobilisée par le froid sans en changer la structure  (1). Pour la microscopie électronique, cette découverte ouvrait, en principe, la possibilité d’observer la matière vivante dans son milieu aqueux alors que, jusque-là, tous les spécimens étaient obligatoirement déshydratés, ce qui est fort fâcheux puisque l’eau est de loin le composant le plus abondant de la matière vivante.  Deux ans plus tard, le rêve était réalisé pour les suspensions, c’est-à-dire pour toutes les particules biologiques flottant en solution liquide, grâce à la méthode de vitrification en couche mince que quelques trucs étonnants de Marc Adrien avaient rendue possible(2). Aujourd’hui, ce sont plus de 1000 scientifiques qui en ont fait leur outil de travail. En même temps, nous mettions en chantier l’improbable projet CEMOVIS (le nom n’est venu que plus tard) destiné à étendre le potentiel de la vitrification  à des objets massifs tels que les tissus ou des organismes complexes. Hélas, aujourd’hui, les cemovistes se comptent encore sur les doigts (mains et pieds).

J’étais récemment à Barcelone, pour la Gordon Research Conference 3d-EM qui réunit toutes les années la crème des spécialistes de la cryo-microscopie électronique (cryo-me). On savait qu’il se passait des choses remarquables, mais, synthèse faite, une impression unanime ressort de cette conférence : la cryo-me semble en voie de produire une révolution en biologie structurale (0). De quoi il s’agit-il ?

Dans ses fameuses « Lectures on Physics » Feynman propose que si une seule phrase devait être transmise aux générations futures, il choisirait : « le monde est fait d’atomes». En effet, la structure atomique est la voie royale pour comprendre comment fonctionne le monde – ou une de ses parties. Par exemple, en biologie, c’est en résolvant la structure atomique de l’ADN que Watson et Crick ont immédiatement pu comprendre le fondement de la réplication des organismes vivants. Le départ était fracassant, la suite fut plus laborieuse (la vie est très compliquée). Le fait est que la connaissance de la structure atomique est nécessaire pour comprendre le fondement de n’importe quel processus biologique.

Par exemple, l’aquaporine est une protéine que Christine aime bien parce qu’elle est vantée dans une crème « jeunesse pour la peau ». C’est elle qui contrôle la quantité d’eau dans les cellules. Il s’agit d’un canal si fin, qu’il ne laisse passer qu’une molécule à la fois – mais il peut en laisser passer un milliard à la seconde –, ou qui se ferme par le tout petit déplacement de quelques atomes du bord du canal.  Il faut regarder de très près pour comprendre comment fonctionne le canal.

La méthode qui a le plus apporté à l’étude des structures atomiques est la diffraction de rayons X (DX) dont on a fêté récemment les 100 ans d’existence. Elle est devenue une véritable industrie, très compétitive et très liée à l’industrie des médicaments. La PDB (la base de données des structures moléculaires biologiques) contient près de 100’000 entrées provenant de la DX. Malheureusement, par principe, la DX ne regarde pas vraiment les objets, mais les cristaux qu’ils peuvent former. Il faut imaginer que, en regardant la forme d’un cristal atomique, on puisse déduire comment les atomes sont arrangés. L’affaire est plus complexe pour une grosse molécule, mais le principe est le même. La nécessité de cristallisation est une sévère limite. En général, dans un cristal, une molécule ne « fonctionne » pas. Comment voir alors, par exemple, comment s’ouvre et se ferme l’aquaporine ?

La PDB contient aussi environ 10’000 entrées qui proviennent d’une méthode toute différente, la RMN. La méthode est difficile et pas souvent applicable.

Finalement, on y trouve aussi 2000 entrées venant de la microscopie électronique. C’est peu et, de ces 2000, seulement quelques-unes sont à une résolution atomique. Il faut bien l’admettre, jusqu’à présent, la microscopie électronique n’était que rarement une méthode de détermination des structures atomiques.

Pourtant elle a un avantage majeur : elle donne une vraie image.

Alors, où est le problème ? En fait, il y en a trois.

1) Préparation des spécimens conservant la structure exacte, dans l’état désiré (par exemple, l’aquaporine dans une conformation ouverte ou fermée).

2) Déduire la structure 3-dimensionnelle de l’objet à partir d’images qui en sont des projections à deux dimensions.

3) Éviter les dégâts que le faisceau d’électrons fait subir au spécimen.

Voyons plus en détail.

 

1) C’est le travail des biochimistes de préparer l’objet de recherche, une belle structure, bien pure et dans la conformation désirée. Le plus souvent, il s’agit d’isoler un de ces superarrangements de macromolécules formant une entité fonctionnelle, machine élémentaire de la vie. L’aquaporine en est un exemple relativement simple (groupement de 4 protéines identiques) ; le ribosome – la machine qui synthétise les protéines – est beaucoup plus complexe avec environ un demi-million d’atomes précisément groupés en une cinquantaine de protéines et 3 morceaux d’ARN; incluons aussi tous les virus et toutes les structures cellulaires qu’il est possible d’isoler fonctionnellement. L’un dans l’autre, la galerie est presque infinie.

Le biochimiste ayant bien fait son boulot, il s’agit de présenter ce matériel dans le microscope électronique. Le problème était sans espoir tant que les spécimens devaient être déshydratés. Pourtant, durant les 50 premières années de la microscopie électronique, la déshydratation semblait être dans la nature de la méthode parce que l’air n’est pas transparent aux électrons et que, conséquemment, la colonne d’un microscope électronique doit donc être sous vide. Hélas, l’eau s’évapore en absence d’air. Tout le drame était là.

La cryo-microscopie a résolu le problème. Selon la méthode de Marc Adrian, une très mince couche de suspension  (1/10 de µm) contenant les particules à étudier est tendue comme une membrane sur un trou (qcq. µm de diamètre) avant d’être projetée dans un bon cryogène qui la vitrifie à -160°C en moins d’un millionième de seconde ; c’est du moins ce que l’on imagine, car on n’a jamais pu mesurer précisément la vitesse de congélation.   La méthode est simple, facile et reproductible ; il suffit d’exercer les petits tours de main qui font l’harmonie de la manipulation. L’observation se fait vers -180°C dans un cryo-microscope électronique ; les constructeurs ont remarquablement travaillé et, si on  y met le prix, leurs machines fonctionnent presque parfaitement. L’essentiel est que, à cette température, l’eau vitrifiée ne s’évapore pas et le spécimen se présente comme s’il était dans son état natif.  En fait, il y aurait ici pas mal de subtilités à mentionner, mais laissons ça aux professionnels.

2) La deuxième difficulté vient du fait qu’une image n’est pas l’objet à 3 dimensions que l’on souhaite représenter. Le problème est classique. Notre cerveau le résout magnifiquement à partir des images que lui fournissent nos yeux. La méthode standard consiste à construire un modèle à trois dimensions à partir de projections de l’objet dans plusieurs directions. C’est ainsi que fonctionne la tomographie aux rayons X et, pour ce faire, c’est  la caméra qui tourne autour de l’objet pour bien le voir sous toutes les coutures. La même méthode s’applique en microscopie électronique, mais elle est difficile parce que l’objet est très petit. Il faut contrôler les mouvements avec une précision un million de fois meilleures que pour la tomographie médicale. C’est pourtant possible et l’on tire, ici encore, un grand coup de chapeau à ceux qui développent ces instruments.

Mais il y a mieux. Chaque spécimen à observer au microscope électronique ne contient pas seulement une particule, mais il en présente généralement des milliers ou des millions immobilisés au hasard dans la mince couche de suspension vitrifiée. Ainsi, une seule image peut contenir des centaines de particules identiques, toutes orientées différemment. L’information 3-d est donc là ; il suffit de la mettre en ordre.  La théorie n’est pas révolutionnaire, mais sa mise en application est une très grosse affaire. Il y a 50 ans qu’on y travaille. Comme souvent, les gens de Cambridge ont été remarquables (Klug, Crowther, Unwin, Henderson), mais il y en a d’autres, nombreux, qui participent au progrès de ce vaste domaine au rythme battu par le développement de l’informatique.

3) Pour voir un objet, il faut l’éclairer ; pour voir un objet très petit, il faut l’éclairer beaucoup ; pour voir un atome, il faut l’éclairer tellement qu’il est rôti avant d’être vu. Que l’éclairage soit de la lumière ou des électrons n’y change rien. Parce que la chimie organique est délicate, la résolution atomique est fondamentalement impossible sur un objet biologique.

Impossible sur un objet unique, mais possible sur un grand nombre d’objets identiques. Ainsi l’analyse des macromolécules par diffraction des rayons X fait appel à des cristaux, formés d’un très grand nombre de molécules identiques arrangées régulièrement. Ainsi, et juste pour illustrer l’idée, supposons que l’atome No 42 de la 850e molécule dans le cristal ait donné un signe de sa présence. La conséquence est que maintenant, il n’est plus au même endroit. Qu’importe, sur celui-ci, on ne reviendra pas, le complément d’information pour localiser ce fameux atome 42 de la molécule, nous le prendrons dans une autre des molécules du cristal. Bref, en diluant les dégâts sur un très grand nombre de molécules, chaque molécule reste presque intacte en moyenne. Ainsi, chacun molécule parle peu, mais, ensemble elles disent tout ce qu’il faut pour en déterminer la structure atomique.

La solution de la microcopie électronique est plus intéressante. Au lieu d’exiger que les particules soient arrangées en cristal, nous allons nous contenter d’un grand nombre de particules identiques orientées au hasard. Il suffit pour cela que le biochimiste obtienne une belle suspension homogène de particules, toutes dans le même état. L’étape de la cristallisation n’a plus lieu d’être. La plus grande limitation de la diffraction des rayons X ne nous concerne pas. Ce que nous avons à faire – ou plutôt, ce que l’ordinateur fera pour nous – consiste à déduire l’orientation de chacune des particules par rapport à une direction fixée arbitrairement. Mathématiquement, il s’agit d’extraire de l’image de chaque particule, la valeur des 3 angles d’Euler, c’est-à-dire trois unités d’information dans une image qui en contient beaucoup plus puis, de sommer dans l’espace 3-d l’information de toutes les particules. Le calcul se fait par approximations successives sur l’ensemble de toutes les données ; c’est un gros calcul. Les ordinateurs actuels le font diligemment.

 

Ainsi donc, les 3 problèmes de base de la détermination des structures moléculaires par microscopie électronique sont en principe résolus pour toute suspension homogène de particules biologiques (3). Wouah ! Et alors.

En 1986   nous avons réalisé la première reconstruction 3-d selon la méthodologie décrite ci-dessus (4). Il s’agissait du SMV (virus de la forêt Semliki). Notre modèle avait une résolution de 35Å.

 

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Aujourd’hui, nos meilleurs collègues résolvent des structures semblables à moins de 3.5Å. En absence de toute symétrie, c’est-à-dire, quand le problème est le plus difficile, il devient « normal » d’atteindre 4.5Å.  C’est le cas de ce mitoribosome (5) publié récemment par un groupe de Cambridge.

Capture d’écran 2014-08-31 à 10.14.32

Par rapport aux résultats d’il y a 30 ans le progrès est étonnant. D’abord il faut constater qu’une amélioration d’un facteur 10 de la résolution signifie que l’élément de volume est 1000 fois plus petit. Ainsi, pour des objets de même dimension, les cartes actuelles contiennent 1000 fois plus d’information que celles du début de la cryo-microscopie électronique. Il faut savoir encore qu’un modèle reconstruit à une résolution approchant 3Å permet de localiser chaque atome dans sa juste position. L’image du mitoribosome ci-dessus ne fait pas justice à ce qu’elle représente ; il y a simplement trop d’information pour la montrer; autant d’atomes placés dans leur juste position que d’habitant dans la région zurichoise. Qu’importe, l’information est là. Elle peut être exploitée.

 

Comment ce progrès a-t-il été rendu possible ? En fait, depuis la vitrification, il n’y a pas eu de découverte fondamentale. La méthode de préparation des suspensions en mince couche vitrifiée que nous avons décrite en 1986 est toujours la méthode de base, utilisée sans modifications notables, si ce n’est que beaucoup la pratique à l’aide d’une machine très chère et très automatique qui, au dire des plus expérimentés, n’apporte pas grand-chose. Si la méthode de préparation est restée la même, le nombre de ceux qui la pratiquent a changé d’ordre de grandeur. En discussion informelle à la récente conférence de Barcelone, nous avons estimé que, par le monde, ils doivent dépasser le millier.  Par contre, depuis les origines de la cryo-me, le traitement des images a immensément évolué en parallèle avec l’effarante augmentation de la puissance des ordinateurs et les vastes efforts en mathématique appliquée qui ont permis d’en tirer avantage. Il semble toutefois que LE progrès qui, ces dernières années,  fait LA différence soit dû à une nouvelle classe de détecteurs d’image.  La plupart d’entre nous en  ont été surpris. Pas tous, il y a longtemps que Richard Henderson insistait que là était le goulet d’étranglement. En principe, le problème est simple ; il y a des électrons qui forment une image ; il suffit d’annoncer leur arrivée, l’un après l’autre, chacun à sa place. Il suffit ! Mais quand il s’agit d’un milliard d’électrons par seconde,  risquant de se confondre entre eux dans un bruit de fond compliqué, le problème est techniquement considérable. Les constructeurs nous l’annonçaient résolu depuis 20 ans, mais les utilisateurs avisés, constataient déçus, que ce ne fût guère le cas. Apparemment la situation a changé. Richard avait raison ; il y a des scientifiques qui sont vraiment très, très bons.

 

En atteignant  le domaine des 3.5 Å et, conséquemment, la résolution atomique, la cryo-me change qualitativement ; elle passe du domaine purement structural à celui de la chimie. De la question « quelle est la forme ? », on passe à « comment ça marche ? ». L’information prend une valeur nouvelle et c’est justement cela qui provoquait la grande agitation ressentie à la récente conférence de Barcelone.  Ainsi, la cryo-me va gagner en intérêt, en intérêt commercial d’abord. La diffraction des rayons X connaît le problème depuis des décennies ; elle reçoit des flots d’argents, mais de l’argent intéressé. La conséquence est que, dans ce domaine, les chercheurs ne se parlent plus et ne communiquent leurs résultats qu’après en avoir assuré l’utilisation commerciale.  Henning Stahlberg concluait la conférence en appelant à défendre l’ouverture de notre domaine. Certains pensent que la bataille est perdue d’avance. Je vois que le verre n’est ni vide ni plein. Certains contribueront à le remplir, d’autres à le vider. Chaque cryo-microscopiste choisira son camp. J’observerai la bataille.

 

Un chapitre est encore à écrire pour compléter la saga de la cryo-me : CEMOVIS. Jusqu’ici nous avons vu comment pouvait être résolue la structure de particules que l’on a pu préparer en grand nombre de copies identiques. En général, ce n’est pas possible ;  deux êtres vivants ne sont jamais identiques et deux morceaux de matière vivante sont toujours différents. Il n’est pas possible de superposer les fragments d’informations lacunaires provenant de particules  différentes pour en faire un tout complet. Il faut se contenter de ce qui peut offrir l’objet unique. Puisqu’une image ne suffit pas à  reconstruire l’objet 3-d il faut l’observer sous toutes ses coutures. Faute de pouvoir tourner autour, c’est l’objet qu’il faut le faire tourner.  Pratiquement il s’agit de photographier le spécimen en changeant son orientation de degré en degré puis d’en faire un modèle 3-d sur la base des quelque 100 images que l’on peut enregistrer en un seul tomogramme. On l’a compris, le spécimen trop fragile pour donner une image en haute résolution ne résistera pas mieux à 100 images. Cette limite incontournable se paie en perte de résolution. Encore en perte de résolution se paie la complexité due à la masse d’information qui se superpose dans l’épaisseur du spécimen.

Le projet de cryo-me que nous avions lancé au début des années 80 comprenait aussi un volet visant à observer les structures complexes de la cellule. Il s’agissait donc de vitrifier un volume substantiel de matière biologique, de le couper en section ultramince que l’on observe directement en cryo-me. Pour la suite nous espérions que les techniques de tomographie pourraient conduire à la modélisation 3-d. Le programme était plus qu’ambitieux ; il semblait utopique ; bien plus tard nous avons donné à la technique le nom de CEMOVIS : cryo-electron-nanoscopy of vitreous sections. L’EMBL offrait un des rares lieux où un tel programme pouvait être poursuivi. Une position de professeur dans une université suisse peut aussi offrir quelquefois une pareille possibilité, s’il reste en parallèle avec un programme plus standard et plus rapidement  productif – ma foi, il faut bien vivre. Moi, je n’ai jamais réussi à pratiquer CEMOVIS – trop diversement occupé et de mains insuffisamment sures –, mais, depuis 1982 jusqu’à ma retraite en 2007 il y a toujours eu, dans mon laboratoire, au moins un doctorant ou un post-doc qui se consacrait au développement de CEMOVIS. La communauté de la cryo-me a toujours reconnu unanimement la beauté de l’idée CEMOVIS, un bon nombre de scientifiques  s’y sont essayés, mais aujourd’hui les CEMOVIStes expérimentés se comptent encore sur les doigts (mains et pieds). C’est peu par rapport aux plus de milles qui pratiquent la cryo-me des suspensions en couche mince.

Il y a plus de 10 ans que de belles reconstructions tomographiques de cellules aplaties, vitrifiées en couche mince sont régulièrement présentées. Les quelques reconstructions semblables  obtenues par CEMOVIS atteignent une meilleure résolution parce que les sections sont plus fines. Les  progrès qui marquent la cryo-me des couches minces se répercutent aussi dans la reconstruction tomographique  et certaines reconstructions du contenu cellulaire qui ont été présentées à la conférence de Barcelone ont laissé  l’assistance effarée. On est loin de la résolution atomique, mais en appliquant les mêmes moyens aux spécimens beaucoup plus minces  que peut produire CEMOVIS, on peut rêver d’atteindre les 10Å – pas dans un avenir indéfini, mais dès maintenant. Il sera possible de reconnaitre des protéines spécifiques ou autres structures caractéristiques à leur forme et peut-être à l’orientation de leur arrangement atomiques les plus marquantes. Il serait alors possible de suivre, par exemple le tracé de l’ADN à l’intérieur du noyau cellulaire (c’est mon rêve depuis 25 ans) et de mettre en position les éléments dont on connaît par ailleurs la structure atomique  (par diffraction X ou cryo-me de particules isolées) pour établir ainsi un modèle atomique réaliste objet biologique complexe. La composition imaginative du bouton synaptique que proposait récemment la couverture de Science pourrait devenir de la vraie réalité (5).

Synapse

Et ainsi, où vais-je me retrouver dans quelques années? Je n’ai pas découvert ou inventé la cryo-me, mais on m’en reconnaît la paternité (6). Vieux gourou, je le suis et vais le rester. J’en suis bien aise sans que ceci n’influence guère mon quotidien. Se peut-il que l’agitation actuelle vienne me chercher ? La probabilité n’est pas considérable, 20% peut-être. Si c’est le cas, il faudra la prendre avec délicatesse.

 

Notes :

0) Smith, M. T. J. and J. L. Rubinstein (2014). « Beyond blob-ology. » Science 345(6197): 617 – 619.

1) En fait, nous n’étions pas les premiers à faire cette découverte inattendue ; l’article d’un groupe autrichien (a) était sous presse dans Nature quand nous avons soumis le nôtre à la même revue. L’histoire de l’évènement est retracée dans (b).

a) Mayer, E. and P. Brüggeller (1980). « Complete vitrification in pure liquid water and dilute aqueous solutions. » Nature 288: 569-571.

b) Dubochet, J. (2011). « Cryo-EM – The first thirty years. » J. Microscopy 245(3): 221 – 224.

2) Adrian, M., et al. (1984). « Cryo-electron microscopy of viruses. » Nature 308: 32-36.

3) Pas tout à fait. Si la particule est trop petite, chaque image pourrait ne pas contenir assez d’information pour déterminer les 3 angles d’Euler. L’addition des informations entre les images des différentes particules n’est pas possible. Nous sommes ainsi dans la situation paradoxale que ce sont les particules les plus simples qui échappent à la microscopie électronique. Tant pis, ce sont les structures pour lesquelles la diffraction X et la RMN  sont particulièrement bien adaptées.

4) Vogel, R. H., et al. (1986). « Envelope structure of semliki forest virus reconstructed from cryo-electron micrographs. » Nature 320: 533-535.

5) Amunts, A., et al. (2014). « Structure of the Yeast Mitochondrial Large Ribosomal Subunit. » Science 343: 1485-1489.

6) Henderson, R. (2004). « Realizing the potential of electron cryo-microscopy. » Q Rev Biophys. 37: 3-13.

 

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